علامة الحجم الوزني الجزيئي
علامة حجم الوزن الجزيئي (molecular-weight size marker)، والتي يشار إليها أيضًا باسم سلم البروتين( protein ladder)أو سلم الحمض النووي (DNA ladder) أو سلم الحمض النووي الريبي (RNA ladder)، هي مجموعة من المعايير التي تستخدم لتحديد الحجم التقريبي لجزيء يعمل على هلام أثناء الفصل الكهربائي ، باستخدام مبدأ أن الوزن الجزيئي يتناسب عكسياً مع معدل الهجرة عبر مصفوفة الهلام. لذلك، عند استخدامها في الفصل الكهربائي للهلامي ، توفر العلامات بشكل فعال مقياسًا لوغاريتميًا لتقدير حجم الأجزاء الأخرى (بشرط معرفة أحجام أجزاء العلامة).
علامات الحمض النووي
عدل
التطوير
عدلعلى الرغم من الاحتفاظ بمفهوم علامات الوزن الجزيئي، فقد تنوعت تقنيات التطوير على مر السنين. حيث يتم توزيع الاختراعات الجديدة للعلامات ذات الوزن الجزيئي في مجموعات خاصة بنوع العلامة.
كانت إحدى المشكلات المبكرة في تطوير العلامات هي تحقيق دقة عالية على طول العلامة بالكامل. [1] اعتمادًا على ظروف تشغيل التحليل الكهربائي للهلام، قد يتم ضغط الأجزاء، مما يؤدي إلى تعطيل الوضوح. و لمعالجة هذه المشكلة، تم تطوير مجموعة لتحليل لطخة ساوثيرن في عام 1990، و التي وفرت أول علامة تجمع بين الحمض النووي المستهدف و الحمض النووي المسبار. فاستفادت هذه التقنية من التباعد اللوغاريتمي، و يمكن استخدامها لتحديد نطاقات مستهدفة تمتد على طول 20000 نوكليوتيد . [2]
التصميم
عدلهناك طريقتان شائعتان لإنشاء علامة حجم الوزن الجزيئي للحمض النووي. تستخدم إحدى هذه الطرق تقنية الربط الجزئي. ربط الحمض النووي هو العملية التي يتم من خلالها ربط قطع الحمض النووي الخطية مع بعضها البعض عبر الروابط التساهمية ؛ و بشكل أكثر تحديدًا، هذه الروابط هي روابط ثنائي أستر الفوسفور . [3] حيث يتم ربط قطعة DNA مزدوجة بطول 100 زوج قاعدي جزئيًا. النتيجة المترتبة على ذلك هي أن ثنائيات من 200bp، و ثلاثيات من 300bp، و رباعيات من 400bp، و خماسيات من 500bp، وما إلى ذلك سوف تتشكل. بالإضافة إلى ذلك، سوف يبقى جزء من dsDNA الذي يبلغ طوله 100bp. و نتيجة لذلك، يتم إنشاء "سلم" DNA مكون من قطع DNA ذات كتلة جزيئية معروفة على الهلام.
الطريقة الثانية تستخدم إنزيمات الاقتطاع و تسلسل الحمض النووي المعترف به. يتم هضم الحمض النووي بواسطة إنزيم اقتطاع معين، مما يؤدي إلى إنتاج قطع من الحمض النووي ذات كتل جزيئية متفاوتة. من بين مزايا هذه الطريقة أنه يمكن إنشاء المزيد من العلامات بسهولة عن طريق هضم المزيد من الحمض النووي المعروف. ومن ناحية أخرى، يعتمد حجم قطع الحمض النووي على المواقع التي يقطعها الإنزيم . و هذا يجعل التحكم في حجم الأجزاء الموجودة في العلامة أكثر صعوبة. [4]
و في الآونة الأخيرة، يتم استعمال طريقة أخرى لبناء علامات حجم الوزن الجزيئي للحمض النووي من قبل المختبرات. تتضمن هذه الاستراتيجية استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) . [4] يتم تحقيق ذلك بطريقة أو طريقتين: 1) يتم تضخيم هدف الحمض النووي في نفس الوقت عبر مجموعات البادئات، أو 2) يتم تضخيم أهداف الحمض النووي المختلفة بشكل مستقل عبر بادئات معينة.
تأثيرات حالة الهلامية
عدلو كما هو الحال مع العينات التجريبية، فإن ظروف الهلام يمكن أن تؤثر على علامة حجم الوزن الجزيئي التي تعمل بجانبها. فيمكن لعوامل مثل المخزن المؤقت ، و الشحنة/ الجهد ، وتركيز الجل أن تؤثر على حركة و/أو مظهر العلامة/السلم/المعيار الخاص بك. لذلك، يجب أخذ هذه العناصر بعين الاعتبار عند اختيار العلامة وعند تحليل النتائج النهائية على الجل.
علامات البروتين
عدلالتطوير
عدلفي السابق، كان يتم تطوير علامات البروتين باستخدام مجموعة متنوعة من البروتينات الكاملة. بدأ تطوير مجموعة تتضمن علامة حجم الوزن الجزيئي استنادًا إلى أجزاء البروتين في عام 1993. يشتمل هذا المؤشر البروتيني، الذي يتكون من 49 تسلسلًا مختلفًا من الأحماض الأمينية ، على بروتينات متعددة المجالات ، ويسمح بتحليل البروتينات المشقوقة في مواقع مختلفة. [5]
تتضمن التحسينات التقنية الحالية في علامات البروتين استخدام التطوير التلقائي. تم اختراع أول علامة بروتينية منتظمة الوزن تم تطويرها ذاتيًا في عام 2012. [6]
التصميم
عدلعلى غرار علامات الحمض النووي، تتكون هذه العلامات عادةً من بروتينات نقية تكون كتلها الجزيئية معروفة بالفعل. تسلط القائمة أدناه الضوء على بعض البروتينات، بالإضافة إلى الكتلة الجزيئية، التي تُستخدم عادةً عند إنشاء علامة بروتينية.
| بروتين | الكتلة الجزيئية ( كيلو دالتون ) |
| بيتا غالاكتوزيداز | 120 [7] |
| فوسفوريلاز ب | 94 [8] |
| ألبومين مصل البقر (BSA) | 67 [8] |
| ألبومين البيض | 43 |
| ألبومين الديك الرومي | 40 [8] |
| كربونيك أنهيدراز | 30 [8] |
| مثبط التربسين الصويا | 20.1 [8] |
| أ-لاكتالبومين | 14.4 [8] |
| الليزوزيم | 14 [9] |
اختيار العلامة البروتينية الصحيحة
عدليمكن تقسيم علامات حجم الوزن الجزيئي إلى فئتين: علامات الوزن الجزيئي مقابل علامات السلم الجزيئي. [10] فتكون العلامات إما ملطخة أو غير ملطخة، وبناءً على الظروف، قد يكون أحدها أكثر ملاءمة من الآخر. يمكن أيضًا تغيير علامات حجم الوزن الجزيئي كيميائيًا. [11] يعتبر الاقتران مع البيوتين هو الأكثر شيوعًا. تُستخدم علامات حجم الوزن الجزيئي بشكل شائع في التحليل الكهربائي للهلام البولي أكريلاميد SDS و التهجين الغربي . مع كل الأنواع و الاستخدامات المختلفة لعلامات حجم الوزن الجزيئي، من المهم اختيار معيار البروتين المناسب. بالإضافة إلى الاستخدام الأكثر شيوعًا، كطريقة لحساب الوزن الجزيئي للعينات، كما تشمل الاستخدامات الأخرى السماح بدليل مرئي على هجرة البروتين و كفاءة النقل، و أحيانًا تُستخدم للتحكم الإيجابي. [12]
تأثيرات حالة الهلامية
عدلكما هو الحال مع التحليل الكهربائي للحمض النووي، يجب أن تؤخذ الظروف مثل المخازن المؤقتة، والشحنة/الجهد، والتركيز في الاعتبار عند اختيار علامة البروتين.
علامات الحمض النووي الريبوزي
عدلالتطوير
عدلتم تطوير سلالم RNA المكونة من علامات حجم الوزن الجزيئي لـ RNA في البداية باستخدام طريقة الدائرة الاصطناعية [13] لإنتاج علامات ذات أحجام مختلفة. تم تحسين هذه التقنية من قبل المخترع إريك تي كول لاستخدام متجهات الحمض النووي الدائرية كطريقة لإنتاج علامات حجم الوزن الجزيئي للحمض النووي الريبي. وتسمى هذه التقنية بطريقة الدائرة المتدحرجة، وتنبع تحسيناتها من كفاءتها في تصنيع أوليجونوكليوتيدات الحمض النووي الريبوزي. فمن قالب الحمض النووي الدائري، يمكن إنتاج الحمض النووي الريبوزي أحادي السلسلة الذي يختلف في الطول من 4 إلى 1500 زوج قاعدي دون الحاجة إلى بادئات ومن خلال إعادة تدوير ثلاثي فوسفات النوكليوتيد . يمكن أيضًا تصنيع الحمض النووي من القالب الدائري، مما يزيد من تنوع هذه التقنية. بالمقارنة مع النسخ الجرياني ، تنتج طريقة الدائرة الاصطناعية أوليجونوكليوتيدات RNA دون الجريان السطحي. بالمقارنة مع تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تنتج طريقة الدائرة الاصطناعية أوليجونوكليوتيدات RNA دون الحاجة إلى بوليميراز أو دورة حرارية . تتميز هذه الطريقة أيضًا بقدرتها على توفير التكلفة من خلال قدرتها على تصنيع كميات كبيرة من المنتج بمعدل خطأ أقل من أجهزة التصنيع الآلية. [13]
التصميم
عدلتتكون علامات الحمض النووي الريبي من نسخ الحمض النووي الريبي ذات أطوال متزايدة مختلفة. على سبيل المثال، تحتوي علامة Lonza 0.5-9 kbp [14] على نطاقات تمثل أزواج 0.5، 1، 1.5، 2، 2.5، 3، 4، 5، 6، و9 كيلو قاعدة . يتم إذابة العلامات في محلول تخزين، مثل EDTA ، ويمكن أن يكون لها مدة صلاحية تصل إلى عامين عند تخزينها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. و لاستخدام العلامة، كما هو الحال في تحليل البقعة الشمالية، يتم إذابتها أولاً، ثم صبغها بحيث يمكن اكتشافها عن طريق التحليل الكهربائي للهلام. أحد أكثر الصبغات المستخدمة في العلامات شيوعًا هو بروميد الإيثيديوم .
يشير نطاق علامة معينة إلى مجموعة متنوعة من النطاقات التي يمكنها تعيينها. حيث يشير النطاق "العالي" إلى شظايا كبيرة نسبيًا (مقاسة بالكيلو بايت) بينما يشير النطاق "المنخفض" إلى العلامات التي تميز بين الشظايا الصغيرة (مقاسة بالزوج الأساسي). و يمكن وصف بعض العلامات بأنها "منخفضة النطاق للغاية"، [12] ولكن العلامة الأكثر دقة هي علامة microRNA التي يمكن استخدامها لقياس شظايا RNA داخل اثني عشر نيوكليوتيدًا، مثل علامة microRNA التي يبلغ طولها من 17 إلى 25 نيوكليوتيدًا. [15]
الاستخدام
عدلعند الأوزان الجزيئية المكافئة، سوف يهاجر الحمض النووي الريبي بشكل أسرع من الحمض النووي. ومع ذلك، فإن كل من الحمض النووي والحمض النووي الريبي لهما ميل خطي سلبي بين مسافة الهجرة والوزن الجزيئي اللوغاريتمي . [16] وهذا يعني أن العينات ذات الوزن الأقل قادرة على الهجرة لمسافة أكبر. لذلك، تعتبر هذه العلاقة من الأمور التي يجب أخذها في الاعتبار عند اختيار علامات RNA أو DNA كمعيار.
عند تشغيل علامات الحمض النووي الريبي وعينات الحمض النووي الريبي على هلام، من المهم منع تلوث النوكلياز ، حيث أن الحمض النووي الريبي حساس للغاية لتحلل الريبونوكلياز (RNase) من خلال التحفيز . [17] [18] ولذلك، يجب أن تؤخذ جميع المواد التي سيتم استخدامها في الإجراء بعين الاعتبار. كما يجب معالجة أي أدوات زجاجية تتلامس مع الحمض النووي الريبي مسبقًا باستخدام ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) و يجب أن تكون المواد البلاستيكية قابلة للتخلص منها. [17]
علامات الحجم الجزيئي والفصل الكهربائي لهلام كبريتات دوديكل الصوديوم متعدد الأكريلامايد(SDS-PAGE)
عدل
أحد الاستخدامات الأكثر شيوعًا لعلامات حجم الوزن الجزيئي هو التحليل الكهربائي للهلام. فيبقى الغرض من هذا الأخير هو فصل البروتينات حسب الخصائص الفيزيائية أو الكيميائية، والتي تشمل الشحنة، والحجم الجزيئي، والرقم الهيدروجيني . < عند الفصل على أساس الحجم، فإن الطريقة المثالية هي الفصل الكهربائي لهلام كبريتات دوديكل الصوديوم متعدد الأكريلامايد ( SDS-PAGE) أو الرحلان الكهربائي للهلام البولي أكريلاميد ، وعلامات الحجم الجزيئي هي المعايير المناسبة للاستخدام.
يمكن أن تختلف الهلاميات في الحجم. لذلك، سيتم تحديد حجم الهلام المناسب بناءً على عدد العينات التي سيتم تشغيلها. و يتم تقسيم جميع الهلاميات إلى مسارات متوازية عبر الهلام. سيحتوي كل مسار على عينة محددة. عادة، يتم وضع معايير حجم الوزن الجزيئي في مسار خارجي. إذا كان الجل يحتوي على عدد كبير بشكل خاص من الممرات، فمن الممكن وضع سلالم متعددة عبر الجل لتحقيق وضوح أعلى.
يتم توزيع البروتينات والمعايير على الهلام في المسارات المناسبة. يتفاعل كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) مع البروتينات، مما يؤدي إلى تغيير طبيعتها وإعطائها شحنة سلبية. نظرًا لأن جميع البروتينات لها نفس نسبة الشحنة إلى الكتلة، فإن حركة البروتين عبر الهلام ستعتمد فقط على الوزن الجزيئي.و بمجرد تشغيل المجال الكهربائي، ستبدأ عملية هجرة البروتين. وبعد الانتهاء من ذلك، يمكن استخدام آلية الكشف مثل النقل الغربي، والتي سوف تكشف عن وجود النطاقات. كل شريط يمثل بروتينًا محددًا. تعتمد مسافة السفر فقط على الوزن الجزيئي؛ لذلك، يمكن تحديد الوزن الجزيئي لكل بروتين عن طريق مقارنة مسافة البروتين غير المعروف بمعيار الوزن الجزيئي المعروف. [19]
استخدامات مختلفة لعلامات الحجم الوزني الجزيئي
عدلهناك العديد من أنواع علامات حجم الوزن الجزيئي، ولكل منها خصائص فريدة، مما يجعلها تشارك في عدد من التقنيات البيولوجية. يعتمد اختيار علامة الحجم الجزيئي على نوع العلامة (DNA أو RNA أو البروتين) ونطاق الطول الذي توفره (على سبيل المثال 1 كيلو بايت). قبل اختيار علامة حجم الوزن الجزيئي، من المهم أن نتعرف على هذه الخصائص والخصائص. في حالة معينة قد يكون نوع واحد أكثر ملاءمة من نوع آخر. على الرغم من أن العلامات المحددة قد تختلف بين البروتوكولات لتقنية معينة، فإن هذا القسم سوف يحدد العلامات العامة وأدوارها.
العلامات المستندة إلى الحمض النووي (ستينيات القرن العشرين)
عدلعلى الرغم من أن الإنزيمات المتغايرة قادرة على اكتشاف الاختلافات في الحمض النووي، إلا أن ذلك يتم بطريقة غير مباشرة وليست دقيقة للغاية. تم تطوير العلامات المعتمدة على الحمض النووي في ستينيات القرن العشرين. [20] تعتبر هذه العلامات أكثر فعالية في التمييز بين المتغيرات في الحمض النووي. و تبقى هذه هي العلامات الأكثر استخدامًا اليوم. تعمل العلامات القائمة على الحمض النووي عن طريق مسح النيوكليوتيدات، والتي يمكن أن تخدم مجموعة متنوعة من الوظائف، مثل الكشف عن الاختلافات في النيوكليوتيدات أو حتى تحديد عدد الطفرات . [20]
العلامات المستندة إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل (1980)
عدلأدى نجاح العلامات المعتمدة على الحمض النووي إلى تطوير تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل. (PCR ). تفاعل البوليميراز المتسلسل هي تقنية تضخيم الحمض النووي والتي يمكن تطبيقها على أنواع مختلفة من القطع. قبل هذا التطور، كان لا بد من استنساخ الحمض النووي أو عزله من أجل تضخيمه. بعد وقت قصير من اكتشاف هذه التقنية ظهرت فكرة استخدام العلامات المعتمدة على هذه التقنية في التحليل الكهربائي للهلام. تعتمد هذه الأنواع من العلامات على برايمرات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتصنف على أنها تعدد أشكال تسلسل الحمض النووي. [20]
تعدد أشكال تسلسل الحمض النووي
عدلعلى الرغم من أن تعدد أشكال تسلسل الحمض النووي من الناحية الفنية كان مستمراً منذ استخدام تقنيةتعدد شكل طول جزء الحصر ( RFLP )في ستينيات القرن العشرين،فهي تعد تقنيات قديمة التي استخدمت على نطاق أوسع. إلا أن التحليل تغير بشكل كبير على مر السنين. تستخدم تعدد أشكال تسلسل الحمض النووي تقنيات أسرع وأكثر كفاءة بكثير حاليا. حيث يتم إجراء التحليل تلقائيًا، لأنه يستخدم تقنية تُعرف باسم تسلسل البندقية. تُستخدم هذه الطريقة عالية الإنتاجية بشكل شائع في علم الوراثة السكانية. [20]
- ^ Carlson، David P. "Size markers for electrophoretic analysis of DNA". US Patent #5316908A. Google Patents. اطلع عليه بتاريخ 2013-10-30.
- ^ Carlson، David P. "Size markers for electrophoretic analysis of DNA". EP Patent #0466404B1. Google Patents. اطلع عليه بتاريخ 2013-10-30.
- ^ Bowen، R (20 أكتوبر 1999). "DNA Ligation". Biotechnology and Genetic Engineering. اطلع عليه بتاريخ 2013-11-12.
- ^ ا ب Lan، Vo Thi Thuong؛ Loan, Pham Thi Thanh؛ Duong, Pham Anh Thuy؛ Thanh, Le Thi؛ Ha, Ngo Thi؛ Thuan, Ta Bich (2012). "Straightforward Procedure for Laboratory Production of DNA Ladder". Journal of Nucleic Acids. ج. 2012: 254630. DOI:10.1155/2012/254630. PMC:3306978. PMID:22496965.
- ^ Hartley، James. "Protein size marker ladder". US Patent #5449758A. Google Patents. اطلع عليه بتاريخ 2013-10-30.
- ^ Cheng، Tian Lu. "Auto-developing and regularly-weighted protein molecular weight marker kit and method for preparing the same". US Patent #20130217133A1. Google Patents. اطلع عليه بتاريخ 2013-10-30.
- ^ "Prestained Protein Molecular Weight Marker". ThermoScientific. اطلع عليه بتاريخ 2013-11-12.
- ^ ا ب ج د ه و Ingelman، Margareta (2004). "Protein separation and analysis". KE7001 Biochemistry Labs. اطلع عليه بتاريخ 2013-11-12.
- ^ "Protein Molecular Weight Markers". Help Biotech. 2011. اطلع عليه بتاريخ 2013-11-12.
- ^ "Protein Molecular Weight Markers Comparison and Selection Guide". اطلع عليه بتاريخ 2013-11-16.
- ^ "Biotinylated Molecular Weight Marker". اطلع عليه بتاريخ 2013-11-16.
- ^ ا ب "Molecular Weight Markers". اطلع عليه بتاريخ 2013-11-16.
- ^ ا ب Kool، Eric T. "Circular DNA vectors for synthesis of RNA and DNA". US Patent #6096880A. Google Patents. اطلع عليه بتاريخ 2013-11-27.
- ^ Lonza. "RNA Markers 0.5–9 kbp" (PDF). Document #18123-0807-06. Lonza Rockland Inc. اطلع عليه بتاريخ 2013-11-27.
- ^ New England Biolabs. "microRNA Marker". New England Bioloabs. اطلع عليه بتاريخ 2013-11-27.
- ^ Wicks، Richard J. (1986). "RNA molecular weight determination by agarose gel electrophoresis using formaldehyde as denaturant: Comparison of rna and dna molecular weight markers". International Journal of Biochemistry. ج. 18 ع. 3: 277–278. DOI:10.1016/0020-711x(86)90118-7. PMID:2937672.
- ^ ا ب "Catalog # : R0004". RNA Marker High Easy. Abnova. اطلع عليه بتاريخ 2013-12-14.
- ^ "RNA Electrophoresis: Introduction". RNA Electrophoresis. Thermo Fisher Scientific Inc. اطلع عليه بتاريخ 2013-12-14.
- ^ "Molecular Weight Determination of Proteins" (PDF). اطلع عليه بتاريخ 2013-12-14.
- ^ ا ب ج د Schlotterer، Christian. "The Evolution of Molecular Markers" (PDF). اطلع عليه بتاريخ 2013-11-26.
تحليل عديد السكاريد عن طريق التحليل الكهربائي للهلام الكربوهيدراتي
عدليتم استخدام علامات الكربوهيدرات في تقنية تُعرف باسم تحليل عديد السكاريد عن طريق التحليل الكهربائي للهلام الكربوهيدراتي (PACE)، وهي تقنية فصل قابلة للقياس. [1] فهو يسمح بتحليل منتجات التحلل الإنزيمي. [1] لقد تم استخدامه في تطبيقات مثل تحديد خصائص الإنزيمات المشاركة في تحلل الهيميسليلوز ، وتحديد بنية عديدات السكاريد الهيميسليلوزية، وتحليل الانقسام الأنزيمي لمنتجات السليلوز . [1]
تعتمد عملية PACE على الاشتقاق، وهو تحويل مركب كيميائي إلى مشتق . [1] [2] هنا، تعتبر السكريات الأحادية ، والسكريات القليلة ، والسكريات المتعددة هي المركبات ذات الأهمية. يتم تمييزها عند نهاياتها المختزلة بعلامة فلورية (أي الفلوروفور ). [1] يسمح هذا الاشتقاق باستخدام الفلوروفور بالفصل على الهلام في ظل الظروف المرغوبة والتصوير الفلوري للهلام. في هذه الحالة، يتم استخدام هلام بولي أكريلاميد. [1]
كما هو الحال مع التحليل الكهربائي للحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين، يتم تشغيل العلامات جنبًا إلى جنب مع العينات ذات الاهتمام في التحليل الكهربائي للهلام الكربوهيدراتي. [1] تتكون العلامات من السكريات القليلة ذات الوزن الجزيئي المعروف. كما هو الحال مع العينات ذات الأهمية، يتم اشتقاق العلامة أيضًا باستخدام الفلوروفور (عادةً باستخدام حمض 8-أمينو نفتالين -1،3،6- ثلاثي السلفونيك (ANTS) أو 2- أمينو أكريدون ). [1]
مراجع
عدل- ^ ا ب ج د ه و ز ح Kosik، Ondrej؛ Bromley، Jennifer R.؛ Busse-Wicher، Marta؛ Zhang، Zhinong؛ Dupree، Paul (2012). Studies of Enzymatic Cleavage of Cellulose Using Polysaccharide Analysis by Carbohydrate gel Electrophoresis (PACE). Methods in Enzymology. ج. 510. ص. 51–67. DOI:10.1016/B978-0-12-415931-0.00004-5. ISBN:9780124159310. ISSN:0076-6879. PMID:22608721.
- ^ Cammack R، Attwood TK، Campbell PN، Parish HJ، Smith A، Stirling JL، Vella F (2006). "Fluorophore". Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (ط. Second). Oxford University Press.